Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）說明書
6×His-Tagged Protein Purification Kit
目錄號： K0894
保 存： 蛋白酶抑制劑混合物，-20℃； 其它組分，2-8℃。
組分說明
Cat.No. K0894 K0894A
KitSize 2ml 5ml
Ni-Agarose 填料 2ml 5ml
細菌裂解液 25ml 65ml
1MTris（pH7.9） 6ml 15ml
1M 咪唑 25ml 65ml
3M 氯化鈉 50ml 2×60ml
蛋白酶抑制劑混合物 0.3ml 0.7ml
親和柱空柱 1個(6ml) 1 個 (12ml)
產品簡介
本試劑盒包含Ni-Agarose 填料、親和柱空柱以及可溶性His 融合蛋白純化所需的全部試劑（細菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結合緩沖液和洗脫緩沖液組分），使用方便。該鎳柱純化系統對6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有6 個組氨酸親和標簽的蛋白。該系統具有4 個 Ni2+ 螯合位點，較只有3 個螯合位點的Ni-IDA 結合 Ni2+ 更為牢固，有效防止純化過程中 Ni2+ 脫落且增強對 His 標簽蛋白的結合能力，提高純化效率。較高的基團密度，大大提高了蛋白載量。該系統在天然或變性條件下，對來源于各種表達系統（如桿狀病毒，哺乳細胞，酵母以及細菌）中的His 標簽蛋白，均有很好的純化效果。本產品已螯合鎳離子，可直接用可溶性蛋白的純化，使用方便，快捷。
支 持 物： CL-6B 瓊脂糖凝膠
載量：20-30mgHis標簽蛋白/ml 填料
粒徑：50-160 μm
注意事項
1. 在純化之前采用電泳檢測蛋白的可溶性，本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化，如需純化包涵體蛋白，請選擇我公司
的包涵體蛋白純化試劑盒，貨號為K0893。
2. 緩沖液中不建議使用 β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。
3. 整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。
4. 為提高純化效率，首先確定BindingBuffer 和 ElutionBuffer 中咪唑的最佳使用濃度。必要時可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度，BindingBuffer 的范圍為0-10mM，洗脫緩沖液的范圍為10-500mM來進行。并通過SDS-PAGE或WesternBlotting 來檢測目的蛋白的純度。
5. 請使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進行離心，或者使用0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。
6. 柱再生時，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。
操作步驟
組裝層析柱
1. 將填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。
注意：（1）填料的上層是乙醇保護層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mgHis標簽蛋白計算，取需要的填料與乙醇的混合 液加入層析柱。
（2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個外力，例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。
（3）本實驗都是通過重力作用使溶液流出。
2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10 倍柱體積的Binding Buffer 平衡柱子，平衡結束后即可上樣。
注意：柱體積指的是填料的體積。
可溶性蛋白的純化（BindingBuffer和ElutionBuffer配方詳見附表1）
1. 收集菌體后，每100mg菌體（濕重）加入1-5 ml細菌裂解液（每1ml 細菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物），超聲裂解菌體。
注意：（1） 當提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時，建議加入DNaseI和Lysozyme。每1ml 細菌抽提試劑中加入1μlDNaseI（1,000U/ml），2μlLysozyme（50mg/ml），DNaseI和Lysozyme可單獨從我公司購買，貨號：Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A)，如使用其它公司產品，請按照相應說明書操作。
（2）超聲過程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實驗中自己摸索，應避免連續超聲導致的大量產熱，可分成短時間，多次超聲，通過一定的間隔時間避免溶液過熱。最終以菌液變清即可。
2. 10000rpm,4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白。
3. 用BindingBuffer將菌體裂解液等倍稀釋后負載上柱，流速為10倍柱體積/小時，收集流穿液。
注意：（1）本試劑盒中附帶有一塊篩板，使用時先將篩板加至填料的上層，該篩板可用于雜質較多的蛋白的過濾，防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負載上柱，但是篩板放入柱子后就不易取出。
（2）通過控制加入的菌體裂解液的速度來控制流速。
4. 使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。
5. 使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。
注意：洗脫峰可以分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白監測儀監測，收集洗脫峰。
6. 洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。
注意：如果是分段梯度洗脫，最大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達到500mM時，則使用濃度為500mM的咪唑進行洗脫10倍柱體積后，再進行第6步的操作。
柱再生
當填料使用多次后，結合效率會有所下降（表現為流速變慢或填料失去藍綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質的結合效率。
1. 使用2 倍柱體積的6M鹽酸胍沖洗后，使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。
2. 使用1 倍柱體積2% SDS沖洗。
3. 依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5 倍柱體積100%乙醇沖洗，再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。
4. 使用1 倍柱體積的去離子水沖洗。
5. 使用5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液（PH8.0）沖洗。
6. 使用3 倍柱體積去離子水，3 倍柱體積20%乙醇沖洗。
7. 4°C 保存。
8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5個柱體積的 50 mM NiSO4再生，3 個柱體積的Binding Buffer 平衡。
附表 1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方
成分 Tris-HCl（PH7.9） 咪唑 NaCl
SolubleBindingBuffer 20mM 10mM 0.5M
SolubleElutionBuffer 20mM 500mM 0.5M
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